Rebecca C. Robbins, DVM; Adam J. Moeser, DVM, PhD; W. E. Morgan Morrow, BVSc, PhD; Jerry W. Spears, PhD; Valeria C. Artuso-Ponte, DVM; Wondwossen A. Gebreyes, DVM, PhD

　　北卡羅來納州立大學獸醫學院人口健康和病理生物學系（羅賓斯，莫瑟）和農業與生命科學學院動物科學系（莫羅，斯皮爾斯），羅利，NC 27695;和俄亥俄州立大學獸醫學院獸醫預防醫學系，俄亥俄州哥倫布市 43210（阿圖索-龐特，格布雷耶斯）。

　　部分在2006年12月于芝加哥舉行的動物疾病研究工作者會議上宣讀。

　　本研究由北卡羅來納州農業和乳制品基金會和德國仹犇泰生物Phytobiotics GmBH支持。

　　摘要

　　目的—評價苯丙菲啶生物堿（QBAs）對沙門氏菌的影響，驗證生物堿是否能對沙門氏菌攻毒后豬的生長性能、病菌潛伏和胃腸道完整性有顯著影響。

　　材料與方法—測定苯丙菲啶生物堿QBAs對沙門氏菌的最低抑菌濃度。將20頭5周齡豬分為4組，并攻毒沙門氏菌。豬分組處理分別包含日糧額外添加苯丙菲啶生物堿QBAs 1.5克/噸飼料， 異喹啉類生物堿QBAs 0.75克/噸飼料，或金霉素59.4克/噸飼料和無添加對照日糧。豬在第0天稱重，然后每周稱重直至40天。收集糞便樣本以量化沙門氏菌菌落數量。通過測量跨上皮電阻TER來評估胃腸道完整性。

　　結果—在體外，36 種 （25%） 沙門氏菌分離菌株中有 9 種在 90 ug/mL 苯丙菲啶生物堿QBA 濃度下被抑制；所有36個沙門氏菌菌株均在179 ug/mL苯丙菲啶生物堿QBA濃度下被抑制。含有苯丙菲啶生物堿QBAs的日糧顯著減少了沙門氏菌菌落；飼喂含有苯丙菲啶生物堿（QBAs）或金霉素的日糧的豬被攻毒后40天的沙門氏菌菌落攜帶量低于飼喂對照日糧的豬群。飼喂含有苯丙菲啶生物堿QBA或金霉素的日糧的豬的表現出的生長性能相似。飼喂含有苯丙菲啶生物堿QBA 1.5 g /噸飼料的日糧的豬群的胃腸道完整性得到改善。結論和獸醫臨床相關性—苯丙菲啶生物堿QBAs和金霉素減少了豬群中沙門氏菌攜帶量，但在生長性能方面沒有表現出差異。在飼喂含有苯丙菲啶QBA的日糧的豬中，胃腸道綜合性更優，盡管沒有統計學顯著差異。后續研究有必要進一步論證苯丙菲啶QBA的作用及其作為免疫調節劑的機制。

　　介紹

　　腸道沙門氏菌是一種普遍存在的腸道病原體。據估計，每年在美國引起 140 萬例人類感染病例^[1]，其中 95% 估計由食源性傳播引起^[2] 。此外，由噬菌體類型（如血清鼠傷寒沙門氏菌 DT1043）引起的耐多種藥物的沙門氏菌引起的感染的發生率增加，以及從豬中攜帶菌株可能對豬肉消費者構成嚴重的健康風險。另外，在包括美國在內的世界大部分地區的豬日糧中添加抗生素物藥物是一種常見的抑菌和促生長方法^[5]。據估計，金霉素是豬生產保育和生長育肥階段飼料中使用最廣泛的抗菌劑^[6]。低劑量喂養抗菌藥物（包括金霉素）雖然以促進生長可以減少腸道病理原的糞便攜帶，并且抗生素類藥物可通過最大限度地減少胴體污染來改善采前食品安全加工。然而，也導致沙門氏菌的耐藥菌的發生概率^[7]。

　　由于人們越來越關注在食用動物中使用低于處理濃度的抗生素所帶來的藥物殘留和細菌耐藥菌發生問題，豬肉行業致力于尋找對用作生長或生產促進劑的傳統抗菌劑替代品；這些抗生素替代品包括傳統草藥、免疫調節劑和益生菌。對草藥提取物的使用而言，目前進行的研究較為有限，特別是那些含有異喹啉類生物堿的草藥提取物，因為它們的消炎抗菌特性^[8]。據報道，異喹啉類生物堿QBA具有抗炎和抗菌特性^[9-12]，可以減少氨基酸降解，增加采食量，促進豬的生長^[13-14]。在1項研究中，當異喹啉類生物堿添加在大鼠飼料中時，顯著減少了對結腸粘膜的損傷并減輕了結腸炎癥，這表明苯丙菲啶QBAs對腸粘膜具有保護作用。苯丙菲啶生物堿QBAs由血根堿和白屈黃素提取物組成。苯丙菲啶生物堿QBAs或任何專有制劑均未評估其對食源性病原體抗菌譜的影響、減少細菌糞便攜帶或改善腸壁屏障功能的研究。因此，本文報告的研究目的是評估苯丙菲啶生物堿QBAs對沙門氏菌致病分離株的體外影響，并比較苯丙菲啶生物堿QBAs與金霉素對保育豬在被攻毒沙門氏菌后的生長性能、飼料效率和糞便病菌攜帶的影響。我們的假設是飼料級抗生素會影響沙門氏菌攜帶量，非抗生素產品（苯丙菲啶生物堿QBAs）可以作為傳統抗生素的潛在替代品。

　　材料和方法

　　動物—該研究使用了20頭5周齡的雜交后備母豬（平均±SD體重，8.96±0.26公斤），糞便中沙門氏菌培養結果均為陰性。這些豬是使用頭孢噻呋處理當天和頭孢噻呋處理后5天獲取糞便樣本中連續2次使用頭孢呋呋喃后檢測沙門氏菌為陰性的豬只。豬在26±2°C的豬欄中單獨飼養（3.05 X 0.76 X 1.37 米）；隔間設有堅固的物理屏障，以防止處理組之間直接接觸導致交叉污染。豬喂食兩階段粉料日糧。第一階段日糧（45%玉米，29%豆粕和19.98%干乳清）飼喂14天。第二階段飲食（62.5%玉米和30%大豆）飼喂14直至40天。根據營養指南制定日糧，營養指標以滿足或超過生長豬的日糧營養需求^[16]。在整個研究過程中提供自由采食飼料和飲水。動物福利認證根據北卡羅來納州立大學動物福利和使用委員會批準的協議。

　　體外測定—按照臨床和實驗室標準協會推薦的標準參考方法，使用瓊脂培養基梯度稀釋培育法評估苯丙菲啶QBAs對各種沙門氏菌SPP菌株的抑制作用。簡而言之，將從Macleaya cordata提取物中獲得的QBA在滅菌的去離子水中稀釋至33 g / L的濃度，并與Müeller-Hinton瓊脂混合，濃度范圍為0至896ug / mL。測試了先前從豬中分離出的36株菌株，包括鼠傷寒沙門氏菌血清型，海德堡和德比，這些菌株代表了易感和多藥耐藥菌株。用復制器系統將新鮮攻毒物懸浮液的斑點放置在瓊脂上。將板在37°C下孵育24小時，目視評估生長情況。

　　實驗設計—使用隨機化程序（即，用軟件生成的隨機數）將豬分配到房間、圍欄和4種實驗日糧中的1種（5頭豬/處理）。豬飼喂添加苯丙菲啶QBAs 1.5克/1000公斤飼料、苯丙菲啶QBAs 0.75克/1000公斤飼料或金霉素59.4克/1000公斤飼料或無添加對照日糧的日糧。按照標簽說明飼喂研究中使用的苯丙菲啶QBAs和金霉素的日糧濃度，以提高體重增加率和飼料效率。豬在第0天對豬進行沙門氏菌菌株致病攻毒，并在40天結束當天對豬群實施安樂死（甲苯噻嗪和戊巴比妥;劑量根據體重確定）。然而，由于與研究無關的條件，飼喂對照日糧的 1 頭豬和飼喂含有苯丙菲啶QBAs 0.75 克/1000 公斤飼料的日糧的 1 頭豬分別在第6和第 13 天被安樂死。

　　沙門氏菌病原體攻毒—鼠傷寒沙門氏菌DT104與五抗藥（氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺甲噁唑和四環素）譜作為致病菌株。該分離物先前已在體外測定期間從豬糞便中分離出來。攻毒物在Lu-ria-Bertani肉湯培養基中生長至對數中期，并在37°C下晃動攪拌。 在第0天，每頭豬通過灌服包含5mL沙門氏菌1.0 X 108 CFU的培養液（通過Müeller-Hinton瓊脂的計數確定）。該劑量與另一項研究中使用的劑量一致^[17]。

　　沙門氏菌分離、抗菌藥敏試驗和定量—在第2、6、12、19、26、33和40天收集每頭豬的糞便樣本。如其他地方所述，用四亞硫酸鹽富集液分離沙門氏菌菌株¹⁸。使用市售抗菌藥敏板測定多達5種沙門氏菌分離株的抗生素耐藥菌株，以確認攻毒菌株是否與從糞便樣品培養的菌株相同。通過Kirby-Bauer平板培養基擴散試驗評估所有分離株的抗菌敏感性。按照三種稀釋 X 3 管 MPN 方法進行定量，并使用 MPN 計算器計算.h 通過 MPN 方法估計為單一類別進行統計分析 < CFU/g 糞便的沙門氏菌落計數。

　　TER測定—跨上皮阻力TER是腸屏障功能的敏感指標，反映了上皮細胞在上皮部位提供的阻力屏障（由上皮間緊密連接的完整性控制）的能力?？缟掀ぜ毎娮鑄ER的測量是在實驗室中進行的，如其他部分所述^[19]。簡而言之，在第40天對豬實施安樂死后立即從每頭豬身上采集新鮮的腸道樣本。收集腸道樣本（回腸組織切片）并將其安裝在電阻測量器上。通過測量每個腸道面積的電阻來確定粘膜屏障功能。通過測量每個腸面積的電阻來確定粘膜屏障功能。測量值記錄為0至80 Ω / cm²之間的連續變量。比較未感染對照豬（²頭來自同一來源豬場，與其他豬具有相同遺傳背景，檢測發現沙門氏菌檢測均表現陰性）和包含金霉素或苯丙菲啶生物堿QBAs 1.5克/1000公斤的沙門氏菌攻毒豬之間的跨上皮細胞電阻TER值。40 Ω/cm² 的 跨上皮細胞電阻TER 被認為是臨床正常豬腸道的正常電阻值。確定中性粒細胞計數作為整體腸道健康的衡量標準，并確認跨上皮細胞電阻TER測定的結果。將回腸組織固定在福爾馬林中并用H&E染色。通過顯微鏡評估定性測量中性粒細胞浸潤的程度，并將其量化為每mm2的中性粒細胞數量。

　　平均增重和飼料轉化率的評估—飼料消耗量計算為提供的飼料重量減去未食用飼料的重量，并報告為干物質基礎上的平均每日采食量。在第0、7、14、21、28、35和40天對豬稱重，以計算增重、加重和飼料轉化率（即飼料消耗與增重之比）。在第40天之前2頭安樂死的豬的數據不包括在這些變量的統計分析中。

　　統計分析—使用單元或非定向檢驗可提高檢測預期方向差異的統計功效20 。其他研究的研究人員21-23發現，在保育豬的日糧中加入抗菌劑可改善生長性能。因此，采用單元檢測攻毒沙門氏菌DT104的保育豬的生長和飼料轉化率的成績。對添加苯丙菲啶生物堿QBAs或金霉素的日糧的豬與對照日糧的豬，結合沙門氏菌攻毒的平均日增重ADG、飼料轉化率FCR和糞便評分的比較。

　　添加苯丙菲啶生物堿QBA的豬與包含飼添金霉素的日糧的豬，以及添加苯丙菲啶QBAs 1.5克/1000公斤飼料的日糧的豬與添加苯丙菲啶QBAs 0.75克/1000公斤飼料的日糧的豬。使用標準統計軟件的Wilcoxon秩和測試進行比較。i 使用標準統計軟件計算處理組中沙門氏菌菌株糞便攜帶的Spearman相關系數.i 使用商業圖形軟件繪制沙門氏菌菌株糞便攜帶與攻毒后時間之間的相關性并檢查。顯著性基于單側檢驗確定；值被認為在P < 0.05時具有顯著性。

　　結果

　　體外測定—測定苯丙菲啶生物堿QBAs對沙門氏菌致病株的體外抑制作用（表1）。在 36 種沙門氏菌分離株中，9 種 （25%） 在苯丙菲啶QBAs 90 ug /mL 時受到抑制；其余27個分離株可以在苯丙菲啶QBA此濃度下生長。然而，所有36種沙門氏菌分離株均在苯丙菲啶QBAs 添加到179 ug /mL的濃度時受到完全抑制。

　　圖1—飼喂添加苯丙菲啶生物堿QBAs 1.5克/1，000千克飼料（A [n = 5]）、苯丙菲啶生物堿QBAs 0.75克/1000千克飼料（B [4]）或金霉素59.4克/1000千克飼料（C [5]）或飼喂未補充對照日糧（D [5]）并通過口服培養基攻毒鼠傷寒沙門氏菌的日糧（D [5]）的沙門氏菌微生物糞便攜帶（C [5]）。攻毒日被指定為第0天。對于每個面板，實線表示數據的相關性

　　ADG和飼料轉化率—增重和飼料效率以ADG和飼料轉化率來測量（表2）。與包含未添加對照日糧的豬相比，包含添加苯丙菲啶生物堿（QBAs）或金霉素的日飼料的豬的ADG或飼料轉化率沒有顯著改善。此外，與包含添加金霉素的日糧的豬相比，包含添加苯丙菲啶生物堿（QBAs）（1.5或0.75 g / 1000 kg飼料）的豬的ADG和飼料轉化率沒有顯著改善。盡管攻毒了沙門氏菌菌株，但生長豬的總體平均日增重和飼料轉化率在預期范圍內¹⁶。

表1.苯丙菲啶生物堿QBAs 90ug/ml和179ug/ml對沙門氏菌各菌株的抑制數量

表2. 飼喂實驗日糧并通過口服鼠傷寒沙門氏菌DT104攻毒的18頭豬的平均±SD體重、平均日采食量、平均日采食量和飼料轉化率

　　接種日被指定為第0天。飼料每天稱重，豬每周稱重。處理組間生長性能變量無顯著差異（P ≥ 0.05）。

　　在為期40天的研究中，通過測量每克豬糞便的菌落單元CFU數量來確定日糧對沙門氏菌微生物糞便攜帶的影響。我們假設沙門氏菌菌落表明鼠傷寒沙門氏菌DT104的糞便攜帶，因為豬在致病攻毒前的結果為陰性;分離后未對分離株進行血清分型或噬菌體分型。包含添加日糧的豬的分布，無論是金霉素還是QBA濃度的豬，都與第26天和第40天飼喂對照日糧的豬有顯著差異。包含添加日糧的豬在第26天排出沙門氏菌的中位數為9.3 CFU/g糞便，且在第 40 天糞便中沙門氏菌菌落數為 2.3 至 2.8 CFU/g，而包含對照飲食的病患豬在第 26 天中位數為 110 CFU/g 糞便，第 40 天的中位數為 24 至 46 CFU/g 糞便。

　　還有發現沙門氏菌的糞便攜帶與每個處理組攻毒后的時間之間存在很強的負相關關系（圖1）。在每組中，攻毒后的時間占>沙門氏菌微生物MPN變異的25%在糞便中攜帶（數據未顯示）。盡管所有處理組的相關性為r ≤–0.50，但最強的線性關系（r = –0.81）是飼喂苯丙菲啶QBAs 0.75 克/1000 公斤處理組。根據反比關系確定，含有苯丙菲啶QBAs 1.5克/1000公斤飼料、苯丙菲啶QBAs 0.75克/1000公斤飼料或金霉素59.4克/1000公斤飼料的日糧顯著降低了沙門氏菌菌株的檢出次數和預期檢出持續時間。盡管與飼喂對照日糧的豬相比，苯丙菲啶QBAs和金霉素處理的豬的沙門氏菌微生物攜帶量有所減少，但總體差異很小。

　　飼喂添加苯丙菲啶生物堿（QBAs）1.5 g /1000 kg飼料的豬的回腸樣本具有更高的平均跨上皮細胞電阻TER（62 Ω / cm²），這表明粘膜屏障的健康狀況增強，與飼喂添加金霉素（41 Ω / cm2）的日糧的豬或未感染的對照豬（2頭來自同一來源豬場并與其他豬具有相同遺傳背景并進行測試的豬）的平均跨上皮細胞電阻TER相比，具有更高的平均跨上皮細胞電阻TER。沙門氏菌陰性 [50 Ω/cm²];圖2）。該測量是在單個時間點（第40天）獲得的樣品上進行的。因此，它沒有提供關于苯丙菲啶生物堿QBAs膳食添加劑是否具有保護作用或導致沙門氏菌菌株致病攻毒后屏障功能修復增強的結論性結果。根據定性和定量中性粒細胞計數確定的，不同處理對回腸樣本的組織學評估沒有差異（結果未顯示）。

圖2—試驗第40天對照處理（n = 4）、苯丙菲啶生物堿QBAs 1.5g/噸飼料或添加金霉素CTC 59.4g /噸飼料處理組對豬回腸樣品的平均跨上皮阻力 ±SD（5）。

　　討論

　　本研究的目的之是要評估QBAs對培養物中沙門氏菌生長的體外影響。濃度為90 u/mL的QBA抑制了3種血清型和4種噬菌體類型的沙門氏菌的生長。這些結果與其他研究一致7，24，25，其中發現QBAs具有抗菌作用。盡管如此，據我們所知，這是鼠傷寒沙門氏菌、海德堡和德比沙門氏菌QBAs最低抑制濃度的第一份報告。然而，體外實驗中使用的QBA濃度高于飼料中通常包含的濃度，并且需要更多涉及使用推薦濃度的飼料級抗菌劑的研究來確定QBA在現場環境中的抗菌作用。

　　在本文報告的研究中，包含添加QBAs或金霉素的日糧的豬的日糧中日均值沒有顯著增加或飼料轉化率降低可能與大學研究機構中豬的最佳飼養和管理條件有關。其他研究的研究人員報告說^[21，22]，生長促進劑的實際效果，特別是那些具有抗菌特性的生長促進劑，往往無法在研究環境中實現，因為這些設施保持清潔和嚴格的生物安全性。具體而言，當日糧中含有低于處理濃度的抗微生物藥物時，商業農場飼養的生豬的生產性能是研究設施中飼養的豬的2倍^[19]。豬沒有混合攻毒或攻毒接種多種病原體，因此日糧對生長性能的影響可能已被掩蓋。作者還認識到，本研究中報告的影響或缺乏顯著影響的可能性可以歸因于低樣本量可能導致的隨機誤差干擾。

　　生長促進劑對豬的性能和健康具有累積的益處^[21，22]。據估計，為生長豬配制的日糧中有80%和為豬配制的育肥日糧中含有至少1種亞處理濃度的抗菌劑，旨在提高生長和飼料效率^[21]。鑒于抗菌劑作為生長促進劑的歷史益處以及目前對確定非抗菌替代品的興趣， 我們認為比較傳統飼料級生長促進劑（金霉素）的生長性能益處與新型非抗菌替代品（QBAs）的益處是相關的。這項研究表明，無論施用哪種生長促進劑，對豬生長和飼料效率的益處都是相似的。與含有金霉素的日糧相比，在整個斷奶后飼喂含有苯丙菲啶生物堿QBAs的日糧的豬的進一步評估也可能揭示出對生長性能的積極益處，而遺憾的是在本研究中無法測量或沒有顯著差異。

　　本研究中評估的博落回植物來源生物堿在攻毒后40天減少沙門氏菌菌株的糞便攜帶方面比金霉素更有效。此外，飼喂含有苯丙菲啶生物堿（QBAs） 1.5 g /1000 kg飼料和苯丙菲啶生物堿（QBAs） 0.75 g /1000 kg飼料的豬的糞便攜帶與攻毒后的時間密切相關（圖1），這表明苯丙菲啶生物堿（QBAs）的使用與攻毒后沙門氏菌糞便攜帶呈負相關關系。沙門氏菌微生物計數程序（MPN計算）的準確性可能影響了分析。盡管該方法被廣泛認為是定量從食品中培養的細菌的標準微生物操作，但考慮到所代表的最高值為110 CFU / g并且無法獲得更高的數值估計值，它似乎不適合大量細菌的計數。似乎作為一種飼料干預策略，可以減少豬飼養和屠宰設施中因豬在糞便中排出大量沙門氏菌微生物而導致的養殖端、屠宰前和屠宰后污染肉品的機會。某些病發事件，包括腸道損傷、腸道疾?。ɡ缟抽T氏菌?。┖蛻?，會引發腸道屏障功能的破壞，這表現在經跨上皮細胞電阻 TER 測量的胃腸道通透性增加。 腸漏（由低 跨上皮細胞電阻TER 表示）允許管腔內物質（如細菌、毒素或抗原）自由穿過腸上皮并進入上皮下組織 ^[26]，一旦有細菌，毒素或抗原突破上皮組織，它們就有可能進入體循環，這可能導致敗血癥，產生多器官疾病和后遺癥。在本研究中，盡管攻毒了沙門氏菌菌株，但所有組的跨上皮細胞電阻TER均等于或高于臨床正常豬腸道屏障的預期跨上皮細胞電阻TER值。此外，苯丙菲啶生物堿（QBAs）飼喂1.5 g /1000 kg飼料的沙門氏菌攻毒豬的平均跨上皮細胞電阻TER比未攻毒的對照豬（2頭來自同一來源豬場，與其他豬具有相同的遺傳背景，經檢測發現沙門氏菌屬陰性）和飼喂金霉素的沙門氏菌攻毒豬的平均ERT高， 分別為12和21 Ω/cm2。如跨上皮細胞電阻TER的增加所示QBA似乎對腸道屏障健康有益。苯丙菲啶生物堿（QBAs）的潛在作用機制尚不清楚，但假設的機制包括調節胃腸道菌群，增強腸道保護和修復腸上皮組織。 需要確定苯丙菲啶生物堿（QBAs）改善腸道健康的具體作用機制。

　　盡管苯丙菲啶生物堿（QBAs）可以通過減少屠宰前沙門氏菌的攜帶而對食品安全和公共衛生提供潛在好處，但它們對豬生產單位中常見的細菌生態和細菌分子流行病學的影響尚不清楚。使用抗菌劑作為生長促進劑被認為是導致細菌種群中抗生素耐藥性擴大的可能存在選擇性抑制^{[5，27，28]};因此，應始終考慮具有抗菌特性的博落回植物生物堿（例如苯丙菲啶生物堿（QBAs））對從自然感染的豬中回收的沙門氏菌群落的抗生素耐藥模式和流行率的潛在影響。因此，有必要在整個斷奶后生產環境中對飼喂苯丙菲啶生物堿（QBAs）再進行評估，這樣或許才能驗證它們是金霉素的可比或合適的替代品的效果，也可以減少商業生產單位豬體內沙門氏菌污染的檢出率。

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